温度和湿度对越冬后苹果褐斑病菌产孢的影响

[目的]褐斑病是引起苹果早期落叶的主要病害之一,本研究通过测定越冬后病菌的产孢条件和动态,明确褐斑病初侵染孢子的形成期和形成量,为病害前期防控提供参考和依据.[方法]2009-2010年在培养箱控温,控湿条件下测定越冬后褐斑病菌产孢所需温度、湿度条件和动态.[结果]越冬后的褐斑病菌在0-30℃都产生拟分生孢子,最适产孢温度为15.5℃.越冬后病菌产孢需要高湿条件.将越冬病叶湿润或直接置于相对湿度97%以上的环境中,病菌在6 h内产生大量拟分生孢子.3月初采集的越冬病叶,在15或20℃下经36 h以上保湿处理后产生少量子囊盘,子囊盘的检出频率为0.34%.5月下旬采集的越冬病叶中,子囊盘的检出频率升至5.3%,形成子囊盘的越冬病叶达27%.[结论]春季,当日均气温达到或超过5℃,遇5mm以上的降雨,被湿润的越冬病叶6 h内可产生大量拟分生孢子.当日均温接近或超过15℃2时,遇24 h以上的阴雨过程,越冬后病菌就产生子囊孢子.拟分生孢子和子囊孢子均具致病性,为褐斑病的初侵染提供大量菌源.     

梨种质资源对腐烂病抗性的室内评价

采用离体枝条分生孢子悬浮液和菌丝块接种测定了11 种梨种质资源共211 份材料对腐烂病的抗性。结果显示：不同种质资源对病菌的侵入和扩展的抵抗均存在差异,抗侵入的占17.5%,抗扩展的占35.1%;同一种质资源对病菌侵入与扩展的抵抗之间也有差异,对病菌侵入和扩展抵抗一致的占30.3%,不一致的占69.7%;所有供试材料中对病菌侵入和扩展均为高抗（HR/HR）的占1.4%,抗病（R/R）的占4.7%,中等（M/M）的占12.3%,感病（S/S）的占10.9%,高感（HS/HS）的占0.9%;通过综合抗性评价发现,‘大香水’、‘杜梨’、‘江岛’、‘康德’、‘龙泉酥’、‘苹果梨’、‘山梨’、‘云红1 号’、‘早玉’和‘长十郎’为抗病（R/R）材料,‘新高’、‘武豆9 号’和‘荆杜3 号’为高抗（HR/HR）材料,‘新星’和‘新黄’为高感（HS/HS）材料。     

苹果小吉丁虫综合防控研究进展

苹果小吉丁虫是果树蛀干害虫,属于国内检疫对象和高度危险性林业有害生物。近20年来,在被誉为野生经济林种质资源基因库的新疆天山野果林发生特别严重,特别是对建群树种—新疆野苹果造成毁灭性的破坏。苹果小吉丁虫在新疆野果林扩散速度快,主要以幼虫钻蛀树干为害,幼虫期时间长。防治手段以幼虫期虫疤涂抹药剂、打孔注药和成虫期喷雾防治为主,防治效果并不理想。研究证明乌黑刻柄茧蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、球腹蒲螨对苹果小吉丁虫有一定的控制作用。建立以寄生性天敌繁育和释放、寄主植物次生代谢物利用、害虫信息素干扰和害虫诱捕的综合防控体系是今后的研究重点。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

2011年烟台苹果产区腐烂病发病情况调查与原因分析

为了解2011年烟台苹果产区腐烂病的发生情况,2011年5月,在腐烂病发病较重的栖霞、海阳等地选择21个农户的果园,对腐烂病的发生情况进行了调查.结果表明,21个果园中具有新病疤的病株率为68.20％,死株率为2.76％,平均受害枝量为23.98％,死枝量10.74％,病株率超过50％的果园占25％～30％,总体发病情况比一般年份严重.调查共发现967块新病疤,平均每株2.32块,其中源自剪锯口的病疤占80.04％,从旧病疤复发的病疤占60.29％.2010年秋季的连续阴雨、冬季低温和2011年春季干旱可能是导致烟台苹果产区2011年春季腐烂病大发生的主要原因.剪锯口是腐烂病菌侵染的主要途径,旧病疤复发是春季腐烂病发病的主体.     

苹果树腐烂病菌高效基因敲除受体菌株ΔVmKu80的构建

为验证苹果树腐烂病菌VmKu80的基因功能,构建高效率基因敲除的受体菌株。通过基因敲除技术获得介导非同源末端连接(NHEJ)途径的VmKu80基因缺失突变体,并对其生长速率、皿内菌落形态、致病力、分生孢子器的形成和基因敲除效率等进行分析。结果表明,该突变体的生长速率、皿内菌落形态、对苹果的致病力和分生孢子器产生等均与03-8菌株无显著差异,且以VmKu80缺失突变体为受体菌株的基因敲除效率是03-8菌株的12倍。说明,VmKu80缺失突变体的获得可以实现苹果树腐烂病菌基因敲除工作的高通量化,有助于苹果树腐烂病菌的基因功能研究。     

新疆野苹果(Malus sieversii)受苹小吉丁虫危害程度与树皮厚度、径阶的关系

为了解新疆野苹果(Malus sieversii)树皮厚度、径阶对苹小吉丁虫危害程度的影响,以具有不同抗苹小吉丁虫(Agrilus mali Matsumura)特性的新疆野苹果类型单株为试验材料,利用相关性回归法找出树皮厚度、径阶与总虫数之间的关系。结果表明:不同野苹果单株受苹小吉丁虫危害差异较大,其中XY-101单株羽化孔数最高11.2个,而XY-49单株最低为0个,总虫口平均数在0.3~11.2头之间,差异均极显著;径阶、树皮厚度分别与总虫数的回归方程为:Y=1.236+0.119Z和Y=1.049+2.071H,在P0.05显著水平下两个方程均通过了t检验,其中变量Z的回归系数为0.119,即径阶每增加1 mm,总虫数就增加0.119个。变量H的回归系数为2.071,即树皮厚度每增大1 mm,总虫数就相对应增加2.071个。因此,新疆野苹果的径阶、树皮厚度与总虫数在一定范围内呈正相关线性关系,随着树皮厚度、径阶的增大,总虫数也明显增大。     

苹果树主要病害内生拮抗真菌的筛选及拮抗特性

【目的】筛选苹果树腐烂病菌Valsa malimiyabe与苹果树炭疽病菌Glomeralla cingalata的内生拮抗真菌,并研究其抑菌效果。【方法】分离发病地区健康苹果树的根、茎及其根际土壤中的拮抗内生真菌,室内抑菌试验测定其对苹果树腐烂病菌和苹果树炭疽病菌的抑制作用;发酵培养试验检测其内生真菌中抑菌物质的耐热性。【结果】分离到的18株内生真菌分属3个属,其中茎分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验表明,对苹果树腐烂病菌和炭疽病菌的抑菌率高于60%的有8株,其中菌株J2、J16、J17对苹果树腐烂病的抑制率分别为82.75%、84.31%和82.35%,菌株T1对苹果树菌株炭疽病的抑制率为80.67%。拮抗真菌J2、J16、J17、J24、T1发酵液对2种病原菌分生孢子萌发的抑制率均不小于39.55%,最高达69.75%;在121℃时,J11和T1无菌滤液的热稳定性较好,而J2无菌滤液在100°C时就失去了生物活性。【结论】拮抗真菌J2、J11、J16、J17、T1均对苹果树腐烂病菌及苹果树炭疽病菌有较强拮抗作用,可为开展这2种病害的生物防治研究提供潜在资源。